Под редакцией Питера Сарноу, Медицинский факультет Стэнфордского университета, Стэнфордский университет, Калифорния, утверждено 25 декабря 2020 г. (проверено 25 октября 2020 г.)
Мы сообщаем о взаимодействии между субъединицами при репликации комплексов коронавирус-транскрипция, которые необходимы для репликации и эволюционной консервации.Мы предоставили доказательства того, что домен NiRAN, связанный с nsp12, обладает активностью трансферазы нуклеозидмонофосфата (NMP) в транс-трансфере, и определили nsp9 (РНК-связывающий белок) в качестве своей мишени.NiRAN катализирует ковалентное присоединение фрагмента NMP к консервативному аминоконцу nsp9 в реакции, которая опирается на ионы Mn2+ и соседние консервативные остатки Asn.Было обнаружено, что активность NiRAN и NMPylation nsp9 необходимы для репликации коронавируса.Полученные данные позволяют нам связать эту активность вложенного вирусного фермента-маркера с предыдущими наблюдениями в рамках гипотезы о том, что инициация синтеза РНК у класса РНК-вирусов функционально и эволюционно согласована.
РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRps) Nidovirales (Coronaviridae, Arterioviridae и 12 других семейств) связана с аминоконцевым (N-концевым) доменом неструктурного белка (nsp), высвобождаемого из полипротеина, называемого NiRAN. 1ab состоит из основной вирусной протеазы (Mpro).Ранее сообщалось о собственной активности GMPylation/UMPylation артериального вируса NiRAN-RdRp nsp, и было предложено генерировать переходный процесс для переноса нуклеозидмонофосфата (NMP) к (в настоящее время неизвестному) вирусу и/или клеточной биополимеризации.Здесь мы показываем, что коронавирус (коронавирус человека [HCoV]-229E и коронавирус тяжелого острого респираторного синдрома 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) обладает Mn2+-зависимой активностью NMPylation, которая происходит от nsp9 посредством образования Mpro-опосредованного nsp9 после N-концевой фланкирующий nsp высвобождается протеолитически, фосфорамидат связывается с первичным амином (N3825) на N-конце nsp9.Уридинтрифосфат является предпочтительным нуклеотидом в этой реакции, но аденозинтрифосфат, гуанозинтрифосфат и цитидинтрифосфат также являются подходящими ко-субстратами.Исследования мутаций с использованием рекомбинантных белков nsp9 и nsp12 коронавируса и генно-инженерных мутантов HCoV-229E определили остатки, необходимые для NiRAN-опосредованного NMP-пилирования nsp9 и репликации вируса в культуре клеток.Эти данные подтвердили предсказание остатков активного центра NiRAN и определили важную роль остатков N3826 nsp9 в NMPylation nsp9 и репликации вируса in vitro.Этот остаток является частью консервативной N-концевой трипептидной последовательности NNE и оказался единственным инвариантным остатком nsp9 и его гомологов в семействе коронавирусов.Это исследование обеспечивает прочную основу для функционального изучения активности NMPylation других вложенных вирусов и предлагает возможные цели для разработки противовирусных препаратов.
Вирус с положительной цепью РНК Nidovirales инфицирует множество позвоночных и беспозвоночных (1, 2).В настоящее время в отряд входят 14 семейств (3), из которых семейство Coronavirus широко изучалось в течение последних 20 лет.Тогда три зоонозных коронавируса вышли из животных-хозяев и вызвали масштабные вспышки тяжелых респираторных инфекций у людей.В том числе стойкие пандемии, вызванные тяжелыми острыми инфекционными заболеваниями.Респираторный синдром Коронавирус 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Нидовирусы имеют общую организацию генома, а субъединица мембраносвязанного репликационно-транскрипционного комплекса (RTC) кодируется в 5-?²-концевых двух третях и основной структурной субъединице вирусной частицы, а также в некоторых аксессуарах. .Белок, закодированный в 3??² концевой трети генома (1).За исключением одного семейства планарийных вирусов (Monoviridae) (8), все вложенные вирусы кодируют субъединицы RTC в двух больших открытых рамках считывания (ORF) ORF1a и ORF1b, которые транслируются с геномной РНК.ORF1a кодирует полипротеин (pp) 1a, а ORF1a и ORF1b совместно кодируют pp1ab.При общем участии основной протеазы (Mpro), кодируемой ORF1a, как pp1a, так и pp1ab протеолитически процессируются во множество неструктурных белков (nsps), также известных как 3CLpro, поскольку он имеет гомологию с 3Cpro пикорнавируса ( 9).Считается, что эти nsps собираются в большой динамический RTC, катализируют синтез геномной РНК (репликация) и набора субгеномных РНК (транскрипция) и используются для координации экспрессии ORF, расположенной ниже ORF1b (10? ? ?12).
Ядро RTC включает РНК-зависимую РНК-полимеразу (RdRp) (13), геликазу суперсемейства 1 (HEL1) (14, 15) и несколько ферментов процессинга РНК, которые в основном кодируются в ORF1b и в семействе коронавирусов. Он содержит nsp12-nsp16 и nsp9-nsp12 семейства Arterioviridae (см. ссылку 10–12).RdRp и HEL1 представляют собой два (одну пятую) консервативных домена вируса «птичьего гнезда» и имеют гомологию среди других РНК-вирусов.Считается, что коровой репликазе помогают другие субъединицы, в том числе несколько небольших nsps, высвобождаемых из карбокси-концевой (С-концевой) области pp1a, расположенной ниже Mpro (коронавирусный nsp5 и артериальный вирус nsp4 соответственно).Они имеют ограниченную защиту семьи и разнообразную деятельность (см. ссылку 10–12).
Сравнительно недавно домен с уникальными характеристиками мотива последовательности был обнаружен на аминоконце (N-конце), прилегающем к RdRp, во всех вложенных вирусах, но не в других РНК-вирусах (16).В зависимости от его местоположения и активности нуклеотидтрансферазы (нуклеозидмонофосфат [NMP]) этот домен получил название NiRAN (нуклеотидтрансфераза, связанная с Nestvirus RdRp).Двухдоменная комбинация NiRAN-RdRp представляет собой nsp12 в семействе Coronaviridae и nsp9 в семействе Arterioviridae, а у других нестовирусов ожидается, что NiRAN-RdRp будет высвобождаться как независимый nsp из вирусного полипротеина.У коронавируса домен NiRAN содержит ??1/450 остатков и связан с С-концевым доменом RdRp через линкерную область (16?19).В вирусе артериита лошадей (EAV) (Arteriviridae) рекомбинантный nsp9 проявляет ион-зависимую (само) Mn2+ активность UMPylation и GMPylation, которая зависит от трех консервативных оснований последовательности в нестовирусе: остатков AN, BN и CN в последовательности.Где N означает NiRAN) (16).N-концевое фланкирование этих мотивов представляет собой менее консервативный мотив preAN.Некоторые из этих остатков также консервативны в отдаленно родственных протеинкиназах, где было показано, что они участвуют в связывании нуклеозидтрифосфата (NTP) и каталитической активности (20, 21).В соответствии с этим наблюдением, несколько ключевых остатков активного центра псевдокиназы SelO из Pseudomonas syringae могут быть собраны с недавно опубликованным суперкомплексом SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13.Консервативные остатки NiRAN коронавируса наложены на электронную микроструктуру.Рекомбинантный белок (17).Предполагается, что документированное (собственное) U/GMPилирование приведет к переходному состоянию для переноса NMP на (на данный момент неизвестный) субстрат (16), а также структурное сходство между NiRAN и протеинкиназой (17, 19). Является ли гипотеза, что NiRAN модифицирует другие белки.
Многие особенности, включая его уникальную и уникальную систематическую связь с вложенными вирусами и генетическое отделение от RdRp, делают NiRAN разумным ключевым регуляторным ферментом для вложенных вирусов, что имеет решающее значение для их возникновения и идентичности.Ранее были названы три возможные функции NiRAN для регуляции геномной/субгеномной трансляции или репликации/транскрипции.Если принять во внимание скудные и неполные данные, доступные на тот момент, каждая функция имеет свои преимущества и недостатки (16).В этом исследовании мы стремимся объединить биохимические и обратные генетические исследования коронавирусов, представляющих два рода, и поместить наши результаты в эволюционную основу естественной мутации семейства коронавирусов, чтобы получить представление об этой загадочной сфере.Мы сообщаем о значительных достижениях в понимании NiRAN благодаря идентификации естественных мишеней в RTC, что (среди трех доступных гипотез) способствует роли этого домена в инициации синтеза вложенной вирусной РНК.Это исследование также открывает возможности для других ролей NiRAN в интерфейсе хоста вируса.
Чтобы охарактеризовать ферментативные свойства домена NiRAN, родственного nsp12 коронирусного вируса, мы получили рекомбинантную форму человеческого коронавируса 229E (HCoV-229E) nsp12 в E. coli с меткой His6 на С-конце и объединили белок с [α32-P] Инкубируйте вместе с NTP в присутствии MnCl2, как описано в разделе «Материалы и методы».Анализ продукта реакции показал наличие радиоактивно меченного белка, мигрирующего вместе с nsp12 (106 кДа), что указывает на то, что коронавирус nsp12 катализирует образование ковалентных аддуктов белок-NMP, преимущественно образующихся с монофосфатом уридина (UMP) (рис. 1А). Б).Количественный анализ показал, что по сравнению с другими нуклеотидами интенсивность сигнала включения UMP увеличилась в 2–3 раза (рис. 1В).Эти данные согласуются с предсказанной трансферазной активностью NMP домена NiRAN коронавируса (16), но указывают на то, что предпочтения нуклеотидов домена NiRAN коронавируса и артериального вируса различны.
Активность само-NMPylation HCoV-229E nsp12.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 кДа) инкубировали с обозначенным [α-32P] NTP в присутствии 6 мМ MnCl2 в течение 30 минут (подробности см. в разделе «Материалы и методы»).Продукты реакции разделяли с помощью SDS-PAGE и окрашивали кумасси бриллиантовым синим.(B) Радиомеченый белок визуализируется с помощью фосфорной визуализации.Положения маркеров молекулярной массы nsp12-His6 и белка (в килодальтонах) показаны на A и B. (C) Интенсивность радиоактивного сигнала (среднее ± SEM) определяли на основе трех независимых экспериментов.*Р<0,05.Уровень сигнала (в процентах) зависит от UTP.
Хотя было показано, что активность ферментов, связанных с NiRAN, необходима для репликации EAV и SARS-CoV в культуре клеток (16), конкретная функция NiRAN и потенциальные мишени еще не определены.Недавно обнаруженное структурное сходство между NiRAN и семейством белков с протеинкиназоподобными складками (17, 22) побудило нас проверить гипотезу о том, что NiRAN катализирует NMPилирование других белков.Мы создали набор потенциальных гомологичных мишеней, включая неструктурные белки, кодируемые HCoV-229E ORF1a (nsps 5, 7, 8, 9, 10), каждая из которых содержит C-концевую метку His6 (приложение SI, таблица S1) и инкубируйте эти белки с [α32-P] уридинтрифосфатом ([α32-P]UTP) в присутствии или в отсутствие nsp12.Альбумин бычьей сыворотки и слитый белок MBP-LacZα, продуцируемый в E. coli, служили контролем (рис. 2А, дорожки 1–7).Радиомеченый белок анализировали электрофорезом в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PAGE) и авторадиографией, и было обнаружено, что в реакции, содержащей nsp12 и nsp9, присутствовал сильный радиоактивный сигнал.Положение сигнала соответствует молекулярной массе nsp9, что указывает на опосредованное nsp12 UMPилирование nsp9 (рис. 2B, дорожка 7).Никакие другие тестируемые белки не были обнаружены UMPилированными, что привело нас к выводу, что nsp9 является специфическим субстратом nsp12.В соответствии с данными само-NMP-пилирования, показанными на рисунке 1, nsp12 способен переносить все четыре NMP в nsp9, хотя эффективность различна: UMP > аденозинмонофосфат (AMP) > гуанозинмонофосфат (GMP) > цитидинмонофосфат (CMP)) ( Картина).3 А и Б).В условиях, использованных в этом анализе (сокращение времени реакции и воздействия, снижение концентрации nsp12; материалы и методы), само-NMPylation nsp12 не могло быть обнаружено (сравните рисунок 2B, дорожку 7 и рисунок 1B), что оказался эффективным (и несколькими раундами) UMP перешел с nsp12 на nsp9.Трансферазная активность UMP требует присутствия ионов Mn2+, как показано на рисунке 3C, тогда как в присутствии Mg2+ наблюдалась только минимальная трансферазная активность UMP, а в присутствии двух других протестированных двухвалентных катионов активность не наблюдалась.Аналогичные данные были получены в анализах NMPylation, содержащих цитидинтрифосфат (CTP), гуанозинтрифосфат (GTP) и аденозинтрифосфат (ATP) (приложение SI, рисунок S1).
HCoV-229E nsp12-опосредованное UMPилирование nsp9.Ряд белковых субстратов (включая бычий сывороточный альбумин, MBP-lacZα и серию nsps HCoV-229E, меченных C-концевым His6, кодируемым ORF1a) использовали для оценки активности UMPylation HCoV-229E, опосредованной nsp12-His6⁺. белок.Инкубируйте белок с [α-32P] UTP в течение 10 минут в отсутствие (А) или присутствии (Б) nsp12, как описано в материалах и методах.Вверху A и B показан полиакриламидный гель SDS, окрашенный кумасси бриллиантовым синим, а внизу A и B показаны соответствующие авторадиограммы.Слева указано положение маркера молекулярной массы белка (в килодальтонах).Также указано положение nsp12-His6 (В, вверху) и радиоактивный сигнал, наблюдаемый при инкубации nsp12-His6 с nsp9-His6 (В, дорожка 7), что указывает на то, что [α-32P]UMP к nsp9-His6 (12,9 кДа), чего не наблюдалось для других протестированных белков.
HCoV-229E NiRAN-опосредованная биохимическая и вирусологическая характеристика NMPylation nsp9.(A и B) Роль нуклеотидного ко-субстрата, используемого в реакции.Nsp12-His6 и nsp9-His6 смешивают и инкубируют в присутствии различных [α-32P] NTP в стандартном анализе NMPylation.(А, вверху) Окрашенный Кумасси nsp9-His6, разделенный с помощью SDS-PAGE.(А, внизу) Авторадиограмма того же участка геля.(B) Относительная активность (среднее значение ± SEM) в присутствии указанного нуклеотидного кофактора определяется на основе трех независимых экспериментов.*Р<0,05.(В) Роль ионов металлов.Показан стандартный тест NMPylation в присутствии [α-32P] UTP и ионов различных металлов, каждый с концентрацией 1 мМ.Вверху С показан окрашенный Кумасси nsp9-His6, а внизу С показана соответствующая авторадиография.Размер меченого белка (в килодальтонах) показан слева от A и C. (D) Мутантная форма HCoV-229E nsp12-His6, несущая указанную аминокислотную замену, находится в [α-32P]UTP, как описано. в «Материалах и методах».Радиомеченый nsp9-His6, образующийся в реакции NMPylation, обнаруживается с помощью визуализации фосфорилирования (D, вверху).Относительная активность по сравнению с белком дикого типа (wt) показана в D, а внизу взято среднее значение (±SEM) из трех независимых экспериментов.Звездочки указывают замены неконсервативных остатков.(E) Титр вируса в культуральном супернатанте клеток p1, полученном через 24 часа после заражения, определяли методом бляшечного анализа.Указаны замены кодонов в домене NiRAN сконструированного мутанта HCoV-229E (нумерация остатков основана на их положении в pp1ab).В качестве контроля использовали мутант активного сайта RdRp с дефицитом репликации nsp12_DD4823/4AA.
Чтобы глубже понять активный центр NiRAN и определить остатки, связанные с активностью nsp9-специфической NMP-трансферазы, мы провели мутационный анализ, в котором заменили консервативные остатки в мотивах NiRAN AN, BN и CN ( 16) Это Ала (приложение SI, рисунок S2).Кроме того, в двух случаях оценивалось влияние консервативных замен Arg на Lys или Lys на Arg.В качестве (отрицательного) контроля остатки, которые не являются или менее консервативны в домене NiRAN коронавирусов и других вложенных вирусов, заменяются на Ala. Замена K4116A (в мотиве preAN), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (мотив BN) и D4280A (CN) значительно снижают или даже устраняют NMPилирование nsp9 через nsp12, тогда как белки с консервативными заменами (R4178K), K4116R) сохраняют 60% и 80% своей активности, что указывает на ослабление ограничений с соответствующей стороны. цепи физико-химически чувствительны (рис. 3D).Замена нескольких других консервативных остатков E4145A, D4273A, F4281A и D4283A гораздо менее вредна, а UMPylation nsp9 снижается лишь умеренно.Аналогичные результаты были получены в реакциях NMPylation nsp9 с участием других NTP (рис. 3D и приложение SI, рис. S3), что подтверждает, что наблюдаемые эффекты на конкретные аминокислотные замены не зависят от типа используемого нуклеотидного ко-субстрата.Затем мы проверили возможное влияние этих замен nsp12 на репликацию коронавирусов в культуре клеток.С этой целью мы использовали соответствующие матрицы генно-инженерной комплементарной ДНК (кДНК), клонированные в рекомбинантном вирусе коровьей оспы (23, 24), для транскрипции 5-7 клеток.Титрование потомства инфекционного вируса, полученного в этих клетках, показало, что большинство мутантов NiRAN HCoV-229E невозможны (рис. 3E).Группа нежизнеспособных вирусных мутантов включает альтернативы, которые, как было показано, устраняют или значительно снижают активность NMP-трансферазы in vitro (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), но существуют еще две альтернативы (K4116R, E4145A) 80 % сдержанный?Их активность NMPylation in vitro предполагает наличие дополнительных ограничений.Аналогичным образом, две другие мутации (R4178K, F4281A), которые вызвали умеренное снижение активности NiRAN NMPylation in vitro, привели к образованию живых вирусов, однако эти вирусы значительно снизили титры за счет репликации.В соответствии с данными активности in vitro, показанными на рисунке 3D, замена четырех других остатков, которые не консервативны в коронавирусе и/или других вложенных вирусах (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16), приводит к образованию жизнеспособных вирусов. Потомство, несмотря на умеренно сниженный титр по сравнению с вирусом дикого типа (рис. 3E).
Чтобы изучить, зависит ли NiRAN-опосредованная активность NMP-трансферазы от активного домена RdRp, два консервативных остатка Asp, участвующих в координации ионов двухвалентных металлов (11) в мотиве C RdRp, были заменены на Ala. Полученный белок nsp12_DD4823/4AA сохраняет его активность NMPylation nsp9, что указывает на то, что nsp12-опосредованная активность NMPylation nsp9 in vitro не требует активности полимеразы (Приложение SI, рисунок S4).
После установления специфичной для nsp9 активности трансферазы NMP для nsp12 мы попытались охарактеризовать аддукт NMP-nsp9 с помощью масс-спектрометрии (МС).Полный масс-спектр белка рекомбинантного HCoV-229E nsp9 показал пик при 12 045 Да (рис. 4А).Добавление nsp12 не изменило качество nsp9, что указывает на то, что nsp12 и nsp9 не образуют стабильный комплекс в используемых условиях (денатурация) (рис. 4А).В присутствии UTP и GTP измерение массы реакции, содержащей nsp9 и nsp12 соответственно, показало, что масса белка UTP переместилась на 306 Да, а масса белка GTP переместилась на 345 Да, что указывает на то, что каждая молекула nsp9 связывает UMP или GMP. (Рисунок 4) C и D).Предполагается, что энергия, необходимая для NiRAN-опосредованного NMP-пилирования nsp9, поступает за счет гидролиза NTP и высвобождения пирофосфата.Хотя в этой реакции использовался 10-кратный молярный избыток nsp9 (мишени) по сравнению с nsp12 (ферментом), наблюдалось почти полное NMPилирование nsp9, что указывает на то, что взаимодействие между nsp12 и nsp9 кратковременно, и nsp12 может NMPилировать больше nsp9. молекула in vitro.
Одиночное NMPилирование nsp9 в присутствии nsp12 и UTP или GTP.Показан деконволютированный полный масс-спектр белка HCoV-229E nsp9 (приложение SI, таблица S1) (AD).(A) только nsp9, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 в присутствии UTP, (D) nsp9 + nsp12-His6 в присутствии GTP.
Чтобы определить остатки nsp9, UMPилированные nsp12, nsp9-UMP расщепляли трипсином.Полученные пептиды разделяли с помощью нано-высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и анализировали с помощью тандемной масс-спектрометрии (МС/МС) онлайн.Анализ данных с использованием пакета программного обеспечения Byonic (Protein Metrics) показал UMPилирование N-концевой аминокислоты.Это подтверждается вручную.Тандемный масс-спектр пептида-предшественника [UMP]NNEIMPGK (приложение SI, рисунок S5A) выявил фрагмент при 421 m/z, что указывает на то, что UMP связывается с остатком 1 nsp9.
На N-конце nsp9 Asn консервативен среди представителей Orthocoronavirinae (приложение SI, рисунок S6).Хотя мы считаем, что N-концевой первичный аминный азот является наиболее вероятным акцептором UMP, мы решили получить дополнительные доказательства связывания NMP на N-конце.По этой причине не-NMPилированный и NMPилированный N-концевой пептид nsp9, очищенный с помощью ВЭЖХ, получали в присутствии ацетона и цианоборгидрида натрия.В этих условиях модифицировать пропилом (25) можно только свободные первичные амины.N-концевой пептид, производный от nsp9, с последовательностью NNEIMPGK содержит два первичных амина, один на N-конце Asn, а другой на боковой цепи Lys на C-конце.Следовательно, пропильные группы можно вводить с обоих концов.Хроматограммы извлеченных ионов не-NMPилированных пептидов показаны в приложении SI, рисунок S5B.Как и ожидалось, можно идентифицировать N-концевые и C-концевые (моно)пропилированные (приложение SI, рисунок S5B, верхняя полоса) и дипропилированные пептиды (приложение SI, рисунок S5B, нижняя дорожка).Эта картина меняется при использовании NMPилированного N-концевого пептида nsp9.В этом случае можно идентифицировать только С-концевые пропилированные пептиды, но N-концевые пропилированные пептиды и дипропилированные пептиды не идентифицируются (Приложение SI, рисунок S5C), что указывает на то, что UMP был перенесен на N-концевой первичный амин. Чтобы предотвратить это группу от внесения изменений.
Затем мы заменяем (на Ala или Ser) или удаляем консервативные остатки на N-конце nsp9, чтобы определить ограничения, специфичные для мишени.Основываясь на наших данных МС, показывающих, что NiRAN образует аддукт nsp9-NMP с первичным амином N-концевого остатка nsp9, мы предположили, что NMPylation nsp9 требует, чтобы вирусная мастер-протеаза (Mpro, nsp5) высвободила N-концевой Nsp9 из его полипротеин-предшественник.Для проверки этой гипотезы мы получили белок-предшественник nsp7-11, содержащий nsp9, в E. coli и провели стандартный тест NMPylation в присутствии [α-32P] UTP (материалы и методы).Как показано на рисунке 5А (дорожка 3), неразрезанный предшественник nsp7-11 не мечен радиоактивным изотопом nsp12.Напротив, если nsp7-11 расщепляется рекомбинантным nsp5 с высвобождением nsp9 (и других nsp) из предшественника, обнаруживается радиоактивно меченный белок, который мигрирует вместе с nsp9, что подтверждает наш вывод о том, что NiRAN и N-селективное образование ковалентных аддуктов nsp9-NMP. .Концевой первичный амин N-концевого Asn (положение 3825 в pp1a/pp1ab).Этот вывод подтверждается также экспериментами с использованием конструкции nsp9, которая содержит один или два дополнительных остатка на N-конце.В обоих случаях NiRAN-опосредованное UMPylation nsp9 было отменено (Приложение SI, рисунок S7).Затем мы получили белок с одним или двумя остатками Asn, удаленными из пептидной последовательности 3825-NNEIMPK-3832 на N-конце nsp9.В обоих случаях UMPylation nsp9 было полностью заблокировано (Figure 5B), что дает дополнительные доказательства того, что настоящий N-конец nsp9 действует как рецептор NMP.
Протеолитический процессинг nsp9 и роль N-концевых остатков в nsp12-опосредованном UMPилировании.(A) UMPylation nsp9 требует свободного N-конца nsp9.Nsp7-11-His6 предварительно инкубируют при 30°C в буфере для обнаружения NMPylation, содержащем UTP, в присутствии или в отсутствие рекомбинантного Mpro (nsp5-His6).Через 3 часа начните анализ NMPylation, добавив nsp12-His6, как описано в разделе «Материалы и методы».В качестве контроля использовали реакцию, содержащую nsp5-His6 (дорожка 1) и nsp9-His6 (дорожка 2).Через 10 минут реакцию прекращали и реакционную смесь разделяли с помощью SDS-PAGE.Белок окрашивали кумасси бриллиантовым синим (А, вверху).Предшественник Nsp7-11-His6 и продукт переработки, полученный в результате расщепления, опосредованного nsp5-His6, показаны справа.Обратите внимание (из-за их небольшого размера), что nsp7 и nsp11-His6 в этом геле не обнаруживаются, а реакция дополняется nsp5-His6 (дорожки 1 и 4; положение nsp5-His6 указано сплошным кружком) или nsp9-His6 (дорожка 2) содержит небольшое количество MBP (обозначено светлыми кружками) в качестве остаточных примесей, поскольку они экспрессируются как слитые белки MBP (приложение SI, таблица S1).(B) Вариант Nsp9-His6 лишен одного или двух N-концевых остатков Asn (нумерация остатков соответствует положению в pp1a/pp1ab) и очищается и инкубируется с nsp12-His6 и [α-32P] UTP.B: SDS-PAGE, окрашенный Кумасси, показан вверху, B, соответствующая авторадиограмма показана внизу.Положение маркера молекулярной массы (в килодальтонах) показано слева.(C) N-концевые консервативные остатки nsp9-His6 HCoV-229E были заменены на Ala или Ser, и такое же количество белка использовалось в реакции UMPylation, опосредованной nsp12-His6.Продукты реакции разделяли с помощью SDS-PAGE и окрашивали кумасси бриллиантовым синим (C, вверху), а радиоактивно меченный nsp9-His6 обнаруживали с помощью фосфоресцентной визуализации (C, посередине).Используя белок дикого типа (wt) в качестве эталона (установленный на 100%), относительную активность NMPylation (среднее значение ± SEM) рассчитывали на основе трех независимых экспериментов.(D) Титры вируса в супернатанте культуры клеток p1 клеток Huh-7, инфицированных клетками Huh-7 дикого типа HCoV-229E, и мутантов, несущих указанные аминокислотные замены в nsp9, определяли методом анализа бляшек.В качестве отрицательного контроля использовали двойной мутант RdRp-мотива C с дефицитом репликации DD4823/4AA.
N-конец nsp9 (особенно позиции 1, 2, 3 и 6) очень консервативен среди членов подсемейства Orthocoronavirinae (приложение SI, рисунок S6).Чтобы изучить возможную роль этих остатков в nsp12-опосредованном NMP-пилировании nsp9, два последовательных остатка Asn на N-конце nsp9 были заменены на Ala или Ser (по отдельности или в комбинации).По сравнению с nsp9 дикого типа замена N3825 на Ala или Ser привела к более чем двукратному снижению опосредованного nsp12 UMPylation (рис. 5C).В соответствии с нашим выводом о том, что NMPylation происходит в N-концевом первичном амине, а не в боковой цепи N-концевого остатка, мы наблюдали значительное остаточное NMPylation с заменой N3825A и N3825S.Интересно, что при замене второго Asn на Ala или Ser UMPylation nsp9 снижается сильнее (более чем в 10 раз), тогда как замена Ala в позициях 3, 4 и 6 оказывает лишь умеренный эффект на UMPylation nsp9 (рис. 2). ) .5С).Аналогичные результаты были получены с использованием АТФ, ЦТФ или ГТФ (приложение SI, рисунок S8).В совокупности эти данные указывают на ключевую роль N2826 (положение 2 в nsp9) в NMPylation nsp9.
Чтобы получить дополнительные доказательства функциональной корреляции между N-концом nsp9 и NMPylation, мы выполнили множественное выравнивание последовательностей (MSA) последовательности nsp9 семейства Coronavirus (варьирующееся между 104 и 113 остатками) (Приложение SI, рисунок). С6).Всего у 47 (известных и предполагаемых) видов 5 родов подсемейства Orthocoronavirinae, инфицирующих различных млекопитающих, птиц и рептилий-хозяев, всего обнаружено только 8 остатков.Наиболее обширные изменения, включая делеции и инсерции, наблюдались в циклах между элементами вторичной структуры nsp9, как было установлено предыдущими структурными исследованиями (26–28).В β-цепи и α-спирали С-концевой части nsp9 обнаружено пять инвариантных остатков.Три инвариантных остатка составляют мотив NNE N-конца nsp9.Выявлено, что второй Asn этого мотива является единственным инвариантным остатком, который также является общим для гипотетического nsp9 отдаленно родственного коронавируса лягушки и представляет собой вид Microhyla letovirus 1 подсемейства Letovirinae Alphaletovirus.Консервативность остатков в элементах вторичной структуры nsp9 может быть рационализирована структурными соображениями для сохранения свойств сворачивания или известных свойств связывания РНК.Однако это рассуждение, по-видимому, не применимо к сохранению NNE, и до этого исследования природа ограничений, ограничивающих изменение трипептидной последовательности, была полностью неясна.
Чтобы определить важность NMPylation nsp9 и консервации NNE при репликации коронавируса, мы создали мутанты HCoV-229E, которые несут одиночные или двойные замены N-концевых остатков nsp9, что указывает на то, что NMPylation nsp9 вреден in vitro.Прежде чем начать, мы попытаемся ответить на вопрос, влияют ли эти замены (вблизи сайта расщепления nsp8|9) на протеолитический процессинг С-концевой области pp1a.Набор полипротеиновых конструкций nsp7-11, содержащих соответствующие замены на N-конце nsp9, был получен в E.coli и разрезан рекомбинантным Mpro.Никакие введенные замены существенно не влияют на протеолитическое расщепление четырех сайтов (включая фланкирующий сайт nsp9) (приложение SI, рисунок S9), за исключением структурных изменений в этих белках, которые мешают Mpro-опосредованному расщеплению nsp8 | 9 (или другое). Веб-сайт.
Клетки Huh-7 были трансфицированы РНК HCoV-229E длиной генома, кодирующей замены Ala или Ser в консервативных трипептидах NNE (N3825, N3826 и E3827) на N-конце nsp9, что показывает, что большинство мутаций фатальны.Нам удалось спасти вирус, заменив Ser или Ala N-концевого Asn (N2835A или N2835S), но не удалось восстановить вирус с другими одиночными и двойными мутациями в последовательности NNE (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS), E3827A) (рис. 5D).
Эти результаты указывают на то, что репликация коронавирусов в тканевой культуре ограничена (такая же или аналогичная), что ограничивает естественную мутацию сайтов NMPylation nsp9 в организме и подтверждает ключевую роль этого ответа в жизненном цикле коронавирусов.
В последней серии экспериментов мы получили C-концевой His6, меченный SARS-CoV-2 nsp12 и nsp9, а также две мутантные формы nsp12 в E. coli.Остатки активного сайта в доменах NiRAN и RdRp были соответственно использованы вместо Ala (рис. 6A и приложение SI, таблица S2).K4465 в nsp12 SARS-CoV-2 соответствует K4135 в HCoV-229E (Приложение SI, рисунок S2), который, как оказалось, необходим для активности NiRAN и репликации HCoV-229E (рис. 3D и E).Этот остаток также соответствует остатку K94 артериального вируса EAV nsp9, который, как ранее было показано, необходим для само-UMPylation/само-GMP-пилирования NiRAN (16).Как показано на рисунке 6B, nsp12 SARS-CoV-2 обладает трансферазной активностью UMP с использованием nsp9 в качестве субстрата, тогда как мутант активного сайта nsp12_K4465A неактивен.Двойная замена в характеристической последовательности SDD мотива C RdRp не влияет на активность трансферазы UMP (рис. 6B), указывая на то, что активность RdRp не оказывает прямого влияния на UMPylation nsp9.Аналогичные данные были получены с использованием CTP, GTP и ATP (приложение SI, рисунок S10).Таким образом, эти данные показывают, что NiRAN-опосредованное NMPylation nsp9 обладает консервативной активностью у коронавирусов, представляющих разные роды подсемейства ортокоронавирусов.
SARS-CoV-2 nsp12-опосредованное NMPилирование nsp9.(A) Окрашенный Кумасси полиакриламидный гель SDS, демонстрирующий рекомбинантный белок, использованный в тесте NMPylation.В качестве контроля использовали мутантный белок с заменой активного центра в домене NiRAN (K4465A) и домене RdRp (DD5152/3AA) nsp12 SARS-CoV-2.Нумерация остатков основана на положении в pp1ab.(B) Авторадиограмма обнаружения UMPylation с использованием nsp9-His6 и [α-32P]UTP в качестве субстрата nsp12-His6 (дикий тип [wt] и мутант).Молекулярная масса (в килодальтонах) меченого белка показана слева.
Домены NiRAN обычно консервативны у Nidovirales (16), что указывает на то, что они катализируют ферментативные реакции, необходимые для репликации нидовируса.В этом исследовании нам удалось доказать, что домен NiRAN коронавируса передает NMP (генерируемый из NTP) в nsp9, загадочный РНК-связывающий белок, участвующий в репликации вируса (26??29), чтобы определить его как естественную мишень и партнер РТЦ по коронавирусу.
Домен NiRAN имеет три мотива последовательности (AN, BN и CN), которые содержат очень небольшое количество остатков, консервативных во всех семействах монофилетического, но высокодифференцированного порядка Nidovirales (8, 16).Недавние исследования показали, что они структурно связаны с малоизученным семейством белков, подобных протеинкиназам, которые первоначально назывались семейством SelO (17, 19, 22, 30, 31).Белки, родственные SelO, имеют киназные складки, но лишены нескольких консервативных остатков активного центра в классических киназах (22, 32).На основании обратной ориентации молекул АТФ, связанных с активным центром и стабилизированных специфическими взаимодействиями, была выдвинута гипотеза, которая впоследствии была подтверждена, что SelO переносит АМФ (вместо фосфата) на белковый субстрат (22), в то время как другой бактериальный SelO-подобный белок YdiU недавно было показано, что он катализирует ковалентное присоединение UMP к остаткам Tyr и His различных белковых субстратов (33).
Чтобы подтвердить и расширить предсказание предполагаемых остатков активного центра домена NiRAN коронавируса, мы использовали методы биохимии и обратной генетики для проведения анализа мутаций коронавируса nsp12 (рис. 3D и приложения E и SI, рисунок S3 и таблица) S1â. С4).Данные показывают, что замена HCoV-229E K4135, R4178 и D4280 на Ala устраняет in vitro активность NMP-трансферазы и репликацию вируса в культуре клеток (рис. 3D и приложения E и SI, рисунок S3), что подтверждает их присутствие в γ-фосфате NTP. (K4135, R4178) и координация ионов металлов активного центра (D4280).Было показано, что замена E4145A на консервативный Glu в диапазоне вируса «птичьего гнезда», которая, как было предсказано, стабилизирует положение K4135 (17), устраняет репликацию вируса, но, что удивительно, активность сохранялась в анализе NMPylation in vitro (рис. 3D и E и Приложение SI, рисунок S3 и таблицы S1–S4).Аналогичное наблюдение было сделано, когда соответствующая замена была введена в гомолог YdiU Salmonella typhimurium (E130A) (33).В совокупности эти данные подтверждают скорее регуляторную функцию этого консервативного остатка, чем каталитическую функцию.
Замена консервативного остатка Phe (F4281A) в диапазоне нестовируса в домене NiRAN HCoV-229E (8) привела к снижению активности NMPylation in vitro и значительному снижению репликации вируса в клеточной культуре (рис. 3D, E и SI). приложение, рисунок S3).Данные согласуются с важной регуляторной функцией этого остатка, такой как гомологичный остаток Phe мотива DFG, показанный ранее.В классических протеинкиназах он является частью петли связывания Mg2+ и помогает собирать и регулировать позвоночник???Необходим для эффективной каталитической активности (32, 34).Замена остатков K4116 (в мотиве preAN) на Ala и Arg соответственно устраняла репликацию вируса и, как и ожидалось, оказывала различное влияние на активность NMP-трансферазы in vitro, в зависимости от введенной боковой цепи аминокислоты (рис. 3D, приложения E и SI). , Рисунок S3).Функциональные данные согласуются со структурной информацией, указывая на то, что этот остаток установил взаимодействие с АТФ-фосфатом (17).В домене NiRAN других вложенных семейств вирусов положение HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116 занято Lys, Arg или His (8), что указывает на то, что функциональное ограничение этого специфического остатка было ослаблено.Замена D4188A и D4283A устраняет или сильно снижает активность фермента и устраняет репликацию вируса (рис. 3).Эти два остатка консервативны в большинстве (но не во всех) вложенных вирусах (8), что указывает на важную, специфичную для семейства, но, возможно, некалитическую функцию.В качестве контроля использовали замены Ala нескольких других остатков Lys и Asp (K4113A, D4180A, D4197A и D4273A), которые не консервативны в Coronaviridae или других семействах Nestioviridae (8).Как и ожидалось, эти замены в значительной степени переносимы, с небольшим снижением активности фермента и репликации вируса в некоторых случаях (рис. 3 и приложение SI, рис. S3).В целом, данные мутагенеза коронавируса очень согласуются с данными само-GMP и обратной генетики EAV NiRAN-RdRp (16), в котором EAV nsp9 (ортолог коронавируса nsp12) остаток K94 (соответствующий HCoV-229E K4135) выполняет важные функции). R124 (соответствует R4178), D132 (соответствует D4188), D165 (соответствует D4280), F166 (соответствует F4281).Кроме того, данные о мутагенезе HCoV-229E согласуются с ранее опубликованными данными обратной генетики SARS-CoV и расширяют их (16), а также очень похожи на те, которые наблюдались для соответствующего мутанта Phe-to-Ala CN-мотива SARS-CoV_nsp12. описанный фенотип -F219A и HCoV-229E_F4281A (рис. 3 D, приложение E и SI, рисунок S3 и таблица S1-S4).
По сравнению с ортологами EAV (16), которые имеют явное предпочтение UTP и GTP (в реакции само-NMPylation), наше исследование показывает, что домен NiRAN коронавируса (представленный HCoV-229E и SARS-CoV-2) может быть эффективно переданы все четыре НМП, хотя есть небольшое предпочтение УМП (рис. 1 и 3).Относительно низкая специфичность специфического ко-субстрата NTP согласуется с недавно опубликованной суперкомпозитной структурой SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13, в которой ADP-Mg2+ связывается с активным сайтом NiRAN, но не с адениновой частью. формирования специфических взаимодействий (17).В нашем исследовании тип нуклеотида, использованного в реакции NMPилирования, не оказывает дифференциального влияния на активность мутантного белка (Приложение SI, рисунок S3), что указывает на то, что ни один из этих остатков не имеет тесного отношения к связыванию конкретного азотистого основания.Структурная основа и потенциальное биологическое значение различных предпочтений ко-субстрата NTP, наблюдаемых в доменах NiRAN коронавирусов и артериальных вирусов, еще предстоит изучить;они могут быть правдой или могут быть обусловлены ограничениями соответствующих исследований.В настоящее время нельзя исключать, что потенциальная NMPylator-активность NiRAN-домена артериального вируса (по сравнению с ранее охарактеризованной активностью само-NMPylation) имеет иное ко-субстратное предпочтение, учитывая сходство артериального и коронавирусного доменов. Домен NiRAN на пределе.Сравнение на основе последовательностей (16).По сравнению с псевдокиназой SelO, которая использует Mg2+ в качестве кофактора, активность коронавируса и артериального вируса NiRAN зависит от Mn2+ (16) (рис. 3C и приложение SI, рис. S1).Зависимость от Mn2+ и явное предпочтение UTP являются необычной особенностью белков NMPylators и лишь недавно были подтверждены в белке YdiU Salmonella typhimurium, который катализирует строгое Mn2+-зависимое шаперонное UMPилирование белка для защиты клеток от индукции стресса. 33).
Недавно описанное структурное сходство между доменом NiRAN коронавируса и клеточными протеинкиназами (17, 19) обеспечивает дополнительную поддержку способности NiRAN ковалентно связывать NMP с другими белками, о которых мы сообщили в этом исследовании.Мы сосредоточили наш поиск возможных мишеней NiRAN на белках, кодируемых HCoV-229E ORF1a, которые, как известно, прямо или косвенно помогают репликазе, кодируемой ORF1b RTC (12, 35).Наши эксперименты предоставили убедительные доказательства эффективного и специфического NMPylation nsp9 (рис. 2).Если целевой белок используется в молярном избытке, который в 8-10 раз превышает молярный избыток фермента (nsp12), подтверждается, что nsp9 полностью (моно)NMPизирован (рис. 4).Мы пришли к выводу, что взаимодействие между nsp12 и nsp9 кратковременно и не образует стабильного комплекса с nsp9 (в отсутствие других субъединиц RTC).Этот вывод подтверждается исследованиями взаимодействия белков в протеоме SARS-CoV (35).МС-анализ идентифицировал первичный амин N-концевого остатка nsp9 как сайт NMPylation (приложение SI, рисунок S5).Образование фосфорамидатной связи и N-концевой аминогруппы отличает NiRAN-опосредованную активность NMPylation от реакции AMPylation, опосредованной Pseudomonas syringae SelO, которая катализирует образование O-связанного AMP по остаткам Ser, Thr или Tyr Пептидный аддукт ( 22), а S. typhimurium YdiU образует О-связанный (с Tyr) и N-связанный (с His) аддукты пептид-UMP.Ограниченная информация, доступная о семействе белков SelO, указывает на то, что члены этого большого семейства белков сильно различаются в образовании аддуктов пептид-NMP.Это интересное наблюдение, заслуживающее дальнейшего изучения.
Данные, полученные в данной работе, позволили нам предположить, что для NMPилирования nsp9 необходим свободный N-конец.В условиях репликации вируса это будет обеспечиваться протеолитическим расщеплением сайта процессинга nsp8|nsp9 в репликазном полипротеине pp1a, опосредованном Mpro и pp1ab.У большинства коронавирусов разница между этим специфическим сайтом (VKLQ|NNEI в HCoV-229E) и всеми другими сайтами расщепления Mpro коронавируса заключается в том, что Asn (а не другой небольшой остаток, такой как Ala, Ser или Gly) занимает P1â???Локация (36).Данные о расщеплении пептида, полученные в ранних исследованиях, показали, что эффективность расщепления сайта nsp8|nsp9 была ниже, чем у других сайтов, что указывает на то, что 1) этот специфический сайт может играть регуляторную роль в своевременном скоординированном процессинге С-концевого pp1a регион, или 2) a Роль специального консервативного N-конца nsp9 в репликации вируса (37).Наши данные (рис. 5А) показали, что рекомбинантная форма nsp9, несущая реальную N-концевую последовательность, эффективно NMP-лизируется nsp12.N-концевую фланкирующую последовательность удаляли с помощью фактора Ха (nsp9-His6; приложение SI, таблица S1) или Mpro-опосредованного расщепления (nsp7-11-His6; рисунок 5A и приложение SI, таблица S1).Важно отметить, что неразрезанный предшественник nsp9, содержащий nsp9-11-His6, продемонстрировал устойчивость к NMPилированию nsp12, что согласуется с нашими данными, указывающими на то, что аддукт nsp9-NMP образуется посредством N-концевого первичного амина (приложение SI, рисунок S5). .Чтобы глубже понять субстратную специфичность NiRAN, мы затем сосредоточились на соседних N-концевых остатках nsp9.В отсутствие других белков они структурно гибки, что не позволяет их обнаружить в немеченой форме nsp9 (26, 28, 38), что указывает на их ограниченную естественную изменчивость. функция N-концевого фрагмента nsp9.Замены Ala консервативных остатков в этой области (рис. 5C и D и приложение SI, рисунок S8) показывают, что N3826 необходим для NMPylation nsp9 in vitro, в то время как замены N3825A и E3827A приводят к снижению NMPylation, тогда как замены M3829A и P3830A не .Очевидно, влияет на NMPylation nsp9.Хотя замена N-концевого Asn (N3825A, N3825S) оказывает лишь умеренный эффект на NMPylation nsp9 и репликацию вируса в клеточной культуре (рис. 5C и D), делеция последовательности остатка Asn из N-концевого дипептида 3825-NN оказалось, что он летален для вирусов, что указывает на то, что один остаток Asn необходим перед другим остатком на N-конце, предпочтительно Asn, хотя кажется, что замена аналогичных остатков может быть частично допустима (рис. 5B, C и D).Мы пришли к выводу, что дипептид 3825-NN, особенно консервативный и незаменимый остаток N3826 в диапазоне коронавируса (приложение SI, рисунок S6), обеспечивает правильное связывание и ориентацию N-конца nsp9 в активном сайте NiRAN.
Замена Ala (E3827A) на консервативный Glu всех подсемейств сохраняет NMPилирование nsp9 in vitro, но является летальным для вирусов в культуре клеток (рис. 5C и D), что указывает на дополнительную функцию этого остатка, например, в ключевых взаимодействиях (NMPилированный или немодифицированный ) N-конец nsp9 и другие факторы, участвующие в репликации вируса.Мутации Nsp9 не влияли на протеолитический процесс nsp9 или любых соседних nssp (39) (Приложение SI, рисунок S9), что указывает на то, что летальные фенотипы нескольких наблюдаемых мутаций nsp9 не были вызваны нарушением регуляции области pp1a на конце протеолитического процесса C. .
Приведенные выше данные свидетельствуют о том, что после Mpro-опосредованной обработки сайта расщепления nsp8|9 в pp1a/pp1ab N-конец nsp9 может быть UMPилирован (или частично модифицирован другим NMP).Кроме того, превосходная консервативность N-конца nsp9 (включая единичные и инвариантные остатки Asn в семействе коронавирусов) и данные обратной генетики, полученные в этом исследовании (рис. 3E и 5D), привели нас к выводу, что описанное NMPylation nsp9 биологически связан и необходим для репликации коронавируса.Функциональные последствия этой модификации еще предстоит изучить, например, в отношении ранее описанной (неспецифической) РНК-связывающей активности nsp9 (немодифицированная форма) (2628).N-концевое NMPylation может также влиять на взаимодействие nsp9 с белковыми или РНК-субстратами или на образование различных четырехуровневых сборок.Они наблюдались в структурных исследованиях и было подтверждено, что они функционально связаны с репликацией коронавируса, хотя особенно в случае отсутствия этой модификации (26-29, 40).
Хотя целевую специфичность домена NiRAN коронавируса еще необходимо охарактеризовать более подробно, наши данные показывают, что специфичность белка-мишени домена NiRAN коронавируса очень узкая.Хотя консервативность ключевых остатков активного сайта (8, 16) в домене NiRAN всех семейств нидовирусов убедительно подтверждает активность консервативного NMPylator этих белков, идентичность остатков субстрат-связывающего кармана этого домена. Консервация и консервативность еще предстоит охарактеризовать. и могут различаться в разных семействах Nidovirales.Точно так же еще предстоит определить соответствующие цели других вложенных вирусов.Они могут быть отдаленными ортологами nsp9 или других белков, поскольку последовательности за пределами пяти доменов репликазы, которые обычно консервативны во вложенных вирусах, менее консервативны (8), включая массив геномов между Mpro и NiRAN. Среди них nsp9 расположен в корона вирус.
Кроме того, в настоящее время мы не можем исключать возможность наличия у домена NiRAN дополнительных (в том числе сотовых) целей.В этом случае стоит упомянуть, что бактериальные гомологи этого нового белка NMPylators (NMPylators) (30, 31), по-видимому, имеют «главные регуляторы»?NMP модулирует различные клеточные белки, регулируя или устраняя их дальнейшую активность, тем самым играя роль во множестве биологических процессов, таких как клеточная реакция на стресс и окислительно-восстановительный гомеостаз (22, 33).
В этом исследовании (рис. 2 и 4 и Приложение SI, рисунки S3 и S5) мы смогли доказать, что nsp12 перенес часть UMP (NMP) в одну (консервативную) позицию в nsp9, в то время как другие белки не были модифицированы в В данных условиях поддерживается четко выраженная (а не расплывчатая) субстратная специфичность.В соответствии с этим, по сравнению с N-концевым NMPylation nsp9, собственная активность NMPylation nsp12 очень низка, ее обнаружение требует более длительного времени авторадиографического воздействия, и используется 10-кратное увеличение концентрации nsp12.Кроме того, наш MS-анализ не смог предоставить доказательств NMPylation nsp12, что позволяет предположить, что самоNMPylation домена NiRAN является (в лучшем случае) вторичной активностью.Однако следует отметить, что другие исследования предоставили предварительные доказательства того, что статус самоАМПилирования бактериальных NMPylator может контролировать их активность NMPylation на других белковых субстратах (22, 33).Таким образом, необходимы дополнительные исследования для изучения возможных функциональных эффектов само-NMPylation, о которых сообщалось для EAV nsp9 (16) и коронавируса nsp12 (это исследование), включая предполагаемый шапероноподобный эффект на сворачивание C-концевого домена RdRp ( 16) ).
Ранее рассматривалось несколько гипотез относительно возможных последующих функций нидовирусного домена NiRAN, включая РНК-лигазу, РНК-кепированную гуанилаттрансферазу и активность праймирования белка (16), но ни одна из них не совместима с доступными нижестоящими функциями.Информация, полученная в следующих позициях, является точно такой же, без каких-либо дополнительных предположений.Полученные в данной работе данные наиболее согласуются (но не могут доказать) с тем, что домен NiRAN участвует в инициации белково-индуцированного синтеза РНК.Ранее считалось, что функция домена NiRAN в 5??Эти и другие данные не влияют на реакции кэпирования ²-РНК или реакции лигирования РНК.Поэтому, например, считается, что активный сайт NiRAN включает в себя консервативный Asp в качестве общего основания (D252 у Pseudomonas syringae SelO; D4271 у HCoV-229E pp1ab; D208 у SARS-CoV-2 nsp12) (Приложение SI, рисунок 2). ).S2) (17, 22, 33), тогда как катализ в АТФ-зависимой РНК-лигазе и РНК-кэпирующем ферменте осуществляется ковалентным интермедиатом фермента - (лизил-N)-NMP, в котором участвует неизмененный остаток Lys ( 41).Кроме того, замечательная основанная на последовательностях специфичность коронавируса NiRAN к консервативным белковым мишеням и ослабленная специфичность к ко-субстратам NTP (предпочитает UTP) противостоит NiRAN-опосредованному кэп-ферменту или функциям, подобным РНК-лигазе.
Очевидно, что необходима большая дополнительная работа для проверки и, если она будет доказана, уточнения возможной роли nsp9-UMP (nsp9-NMP) в синтезе РНК, индуцируемом белком, что свяжет несколько интересных, но (пока) сообщений, о которых сообщалось ранее. .Изолированные наблюдения.Например, было установлено, что конец отрицательной цепи РНК коронавируса начинается с цепи олиго(U) (42, 43).Это наблюдение согласуется с идеей о том, что синтез РНК с отрицательной цепью инициируется связыванием UMPилированной формы nsp9 с поли(А)-хвостом (триггерами), чему может способствовать его связывание с РНК. Активность и/или взаимодействие с еще один белок RTC.Часть UMP, обеспечиваемая nsp9, затем может быть использована в качестве «праймера» для nsp7/8/nsp12-опосредованного олигоуридилирования с использованием 3??²-поли(А) хвоста в геномной РНК или другой олиго(А)-содержащей последовательности. служит матрицей, аналогично механизму, установленному для белка VPg пикорнавируса (44).Что, если предложение является «ненормативным»????Инициация (индуцированного белком) синтеза РНК с отрицательной цепью обеспечивает связь с наблюдениями, указывающими на то, что РНК с отрицательной цепью коронавируса имеет на конце UMP (вместо UTP) (42), что, как полагают, указывает на то, что нуклеиновая кислота Dicer расщепляет конец, фосфорилированный неизвестной уридин-специфичной эндонуклеазой.Если это подтвердится, эта гидролитическая активность нуклеиновой кислоты может помочь высвободить олигомерную UMPилированную форму nsp9 из 5²-конца образующейся отрицательной цепи.Возможная роль nsp9 в праймировании белка также согласуется с предыдущими исследованиями обратной генетики, которые показали, что nsp9 (и nsp8) критически и специфично взаимодействуют с консервативным цис-действующим элементом РНК вблизи 3-конца генома коронавируса.45).Согласно этому отчету, эти предыдущие наблюдения теперь могут быть пересмотрены и расширены посредством дальнейших исследований.
Таким образом, наши данные определили специфическую активность собственной вложенной вирусной ферментной метки, связанной с RdRp на N-конце.В коронавирусе эта недавно обнаруженная NiRAN-опосредованная активность UMPylator/NMPylator используется, чтобы полагаться на Mn2+ и соседние остатки Asn и вызывать образование (низкоэнергетических) фосфорамидатных связей с N-концевым первичным амином.Благодаря Mpro-опосредованному расщеплению в сайте расщепления nsp8|9 мишень nsp9 может использоваться для NMPylation, что указывает на функциональное соединение между протеазой и доменом NiRAN, которое распространяется на RdRp.Консервация ключевых остатков в активном сайте NiRAN nsp12 и мишени nsp9 в сочетании с данными, полученными от двух коронавирусов, включая SARS-CoV-2, предоставляет убедительные доказательства того, что NMPylation nsp9 является коронавирусом. Консервативные функции также являются ключевым этапом репликации вируса.Имеющиеся данные позволяют нам сделать вывод, что специфическая роль NMPилированной формы nsp9 в белково-индуцированном синтезе РНК является разумным сценарием для коронавируса и других вложенных вирусов, а NiRAN может также воздействовать на другие неопознанные белки.Регулируйте вирус.Взаимодействие с хостом.Если это подтвердится, участие белковых праймеров в синтезе вирусной РНК увеличит близость последовательностей доменов Mpro/3CLpro и RdRp между ранее обнаруженным коронавирусом и пикорнавирусоподобной супергруппой (9), которые теперь объединены в недавно созданные пизонивириты (9). 46) в категории.
Наши данные также показывают, что основные, селективные и консервативные активности ферментов, выявленные в этом исследовании, могут быть использованы в качестве мишеней для противовирусных препаратов.Соединения, которые препятствуют связыванию (и последующей модификации) консервативного N-конца nsp9 в активном центре NiRAN, могут быть превращены в эффективные и универсальные противовирусные препараты, подходящие для лечения коронавирусов животных и человека различных (под)родов. , включая SARS-CoV-2 и коронавирус ближневосточного респираторного синдрома.
Кодирующая последовательность белка коронавируса, полученная в этом исследовании, была амплифицирована с помощью RT-PCR с использованием РНК, выделенной из Huh-7, инфицированного HCoV-229E, или Vero E6, инфицированного SARS-CoV-2, и вставлена с использованием стандартных процедур клонирования.Вектор экспрессии pMAL-c2 (Биологическая лаборатория Новой Англии) или pASK3-Ub-CHis6 (47) (Приложение SI, Таблицы S1 и S2).Замены одиночных кодонов были введены с помощью сайт-направленного мутагенеза на основе ПЦР (48).Для получения слитого белка MBP клетки E. coli TB1 трансформировали соответствующей плазмидной конструкцией pMAL-c2 (приложение SI, таблица S1).Гибридный белок очищали аффинной хроматографией на амилозе и расщепляли фактором Ха.Впоследствии белок, меченный His6 на С-конце, очищали с помощью аффинной хроматографии с иммобилизованным Ni металлом (Ni-IMAC), как описано ранее (49).Для получения слитого белка убиквитина в клетках E. coli TB1 использовали соответствующую плазмидную конструкцию pASK3-Ub-CHis6 (Приложение SI, таблицы S1 и S2) и плазмидную ДНК pCGI, кодирующую убиквитин-специфическую C-концевую гидролазу 1 (Ubp1).Трансформация (47).С-концевой белок коронавируса, меченный His6, очищали, как описано ранее (50).
Тест на само-NMPylation HCoV-229E nsp12-His6 проводили, как описано в EAV nsp9 (16).Короче говоря, nsp12-His6 (0,5 мкМ) содержит 50 мМ 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновой кислоты (HEPES)-KOH, pH 8,0, 5 мМ дитиотреитола (DTT), 6 мМ MnCl2, 25 мкМ буфера, инкубировать. указанный NTP и 0,17 мкМ соответствовали [α32-P]NTP (3000 Ки/ммоль; Hartmann Analytic) при 30 °C в течение 30 минут.Во всех других (стандартных) анализах NMPylation nsp12-опосредованного NMPylation nsp9 условия реакции корректируют следующим образом: nsp12-His6 (0,05 мкМ) и nsp9-His6 (4 мкМ) в присутствии 50 мМ HEPES-KOH (pH 8,0). ), 5 мМ DTT, 1 мМ MnCl2, 25 мкМ указанного NTP и 0,17 мкМ соответствующего [α32-P]NTP.После инкубации в течение 10 минут при 30°C реакционный образец смешивали с буфером образца для SDS-PAGE: 62,5 мМ трис(гидроксиметил)аминометан HCl (pH 6,8), 100 мМ DTT, 2,5% SDS, 10% глицерина и 0,005% бромфенола. синий.Белок денатурировали нагреванием при 90°C в течение 5 минут и разделяли с помощью 12% SDS-PAGE.Гель фиксируют и окрашивают раствором кумасси бриллиантового синего (40% метанола, 10% уксусной кислоты, 0,05% кумасси бриллиантового синего R-250), обесцвечивают и подвергают воздействию фосфоресцентного визуализирующего экрана в течение 20 часов (для обнаружения nsp12 в результате NMPylation). или (максимум) 2 часа (для оценки NMPylation nsp9).Для сканирования экрана использовался имидж-сканер Typhoon 9200 (GE Healthcare), а для анализа интенсивности сигнала — ImageJ.
Для МС-анализа в анализе NMPylation (приложение SI, таблица S1) использовали 1 мкМ nsp12-His6 и 10 мкМ nsp9 (без гексагистидиновой метки), а также использовали повышенную концентрацию 500 мкМ UTP и GTP.В зависимости от их концентрации и ожидаемого качества белка, систему ВЭЖХ Waters ACQUITY H-Class, оснащенную колонкой MassPrep (Waters), использовали для обессоливания от 1 до 10 мкл буферных белковых растворов в режиме онлайн.Обессоленный белок элюируют в источник ионов электрораспыления масс-спектрометра Synapt G2Si (Waters) через следующий градиент буфера A (вода/0,05% муравьиной кислоты) и буфера B (ацетонитрил/0,045% муравьиной кислоты), а температура колонки составляет 60°С и скорости потока 0,1 мл/мин: изократическое элюирование 5% А в течение 2 минут, затем линейный градиент до 95% В в течение 8 минут и поддержание 95% В в течение еще 4 минут.
Обнаруживаются положительные ионы с массовым диапазоном от 500 до 5000 m/z.Глу-фибринопептид B измеряется каждые 45 секунд для автоматической коррекции отклонения массы.Используйте инструментальное программное обеспечение MassLynx с расширением MaxEnt1 для деконволюции среднего спектра после вычета базовой линии и сглаживания.
UMPилированный HCoV-229E nsp9 расщепляли добавлением модифицированного трипсина, пригодного для секвенирования (Serva), и инкубировали в течение ночи при 37°C.Для обессоливания и концентрирования пептидов использовали центрифугирующую колонку Chromabond C18WP (номер детали 730522; Macherey-Nagel).Наконец, пептид растворяли в 25 мкл воды, содержащей 5% ацетонитрила и 0,1% муравьиной кислоты.
Образцы анализировали методом МС с использованием масс-спектрометра Orbitrap Velos Pro (Thermo Scientific).Новейшая нано-ВЭЖХ-система (Dionex), оснащенная специальным торцевым 50-см ??Колонка C18 RP 75 мкм, заполненная магнитными шариками размером 2,4 мкм (Dr. Albin Maisch High Performance LC GmbH). Подключитесь к масс-спектрометру онлайн через источник наноспрея Proxeon;введите 6 мкл раствора для расщепления трипсина во внутренний диаметр 300 мкм ×??Колонка для концентрирования C18 PepMap диаметром 1 см (Thermo Scientific).Используя воду/0,05% муравьиную кислоту в качестве растворителя, образец автоматически улавливали и обессоливали со скоростью потока 6 мкл/мин.
Для разделения триптических пептидов при скорости потока 300 нл/мин использовали следующие градиенты воды/0,05% муравьиной кислоты (растворитель А) и 80% ацетонитрила/0,045% муравьиной кислоты (растворитель В): 4% В для 5 минут, затем линейный градиент 30 A до 45% B в течение нескольких минут и линейное увеличение до 95% растворителя B в течение 5 минут.Подсоедините хроматографическую колонку к наноэмиттеру из нержавеющей стали (Proxeon) и распылите элюент непосредственно на нагретый капилляр масс-спектрометра, используя потенциал 2300 В. Обзорное сканирование с разрешением 60 000 в масс-анализаторе Orbitrap связано с с минимум тремя сканами данных МС/МС, динамически исключенными в течение 30 секунд, с использованием диссоциации, вызванной столкновением с линейной ионной ловушкой, или диссоциации при столкновении с более высокой энергией в сочетании с обнаружением орбитальной ловушки. Разрешение составляет 7500.
Время публикации: 03 августа 2021 г.